KỸ THUẬT PCR

KỸ THUẬT PCR

3/13/2021 3:57:18 PM

KỸ THUẬT PCR

I. NGUYÊN TẮC

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction nghĩa là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt.

II. CHUẨN BỊ

Phương tiện, hóa chất

  1. Máy luân nhiệt PCR
  2. Máy chụp gen
  3. Máy điện di
  4. Máy ly tâm Eppendorf 10.000
  5. Máy lắc có điều chỉnh nhiệt độ
  6. Máy khuấy từ
  7. Máy trộn vortex
  8. Máy đo pH
  9. Cân điện tử
  10. Tủ lạnh 4oC, - 20oC và – 80oC
  11. Tủ ấm
  12. Ống hút
  13. Đầu týp các cỡ
  14. Ống Eppendorf các cỡ: 0,2; 0,5; 1,5ml
  15. Găng tay các loại, khẩu trang, mũ, áo choàng, kính bảo hộ.
  16. NaCl 0,09%
  17. Kít tách chiết DNA
  18. Dung dịch đệm
  19. Nước cất
  20. Thạch điện di (electrophoresis agar)
  21. Thang chuẩn DNA 100bp
  22. Ethidiumbromide
  23. Chứng dương
  24. Chứng âm
  25. Đèn cực tím
  26. Enzym polymerase chịu nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa ở 72°C và bền được với nhiệt độ.
  27. 4 loại desoxyribonucleotid (dNTP) là Adenin, Thymin, Guanin và Cystosin (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
  28. DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng.
  29. Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotid có chiều dàikhoảng 20-30 nucleotid có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản.
  30. Ion Mg  trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp;
  31. Dung dịch đệm Tris-KCl làm dung môi thích hợp cho phản ứng, khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ của máy luân nhiệt.

 

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Tách chiết DNA (RNA) khuôn mẫu: cách tách chiết DNA/RNA tùy thuộc vào loại mẫu, thường là lấy từ vật chủ tại nơi mà người lấy mẫu cho rằng có hiện diện của DNA tác nhân đích và do vậy cần lấy đúng chỗ. Thí dụ mẫu thử là vi khuẩn, người ta lấy 4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất, đun cách thủy ở 950C trong 5 phút rồi ly tâm 10.000 vòng/phút x 2 phút và lấy dịch nổi làm khuôn mẫu DNA. Với mẫu mô sinh thiết, người ta tách chiết bằng phenol/clorofom (không dùng BOOM vì mẫu mô thường có nhiều DNA nên DNA đích không thể cạnh tranh để hấp phụ lên hạt silica và cũng không sử dụng BOOM cho tách chiết RNA).

- Đầu tiên, nhiệt độ được đưa lên 94°C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính.

- Tiếp theo, nhiệt độ được hạ xuống 56°C-65°C là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn này được gọi là giai đoạn bắt cặp.

- Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72°C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzym Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành 2 bản sao và nếu chu kỳ này lặp lại liên tục 30-40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản thành 230 đến 240 bản sao, nghĩa là hàng tỷ bản sao.

- Điện đi trên thạch (electrophoresis agar), nồng độ từ 1,5% -2% tùy theo kích thước đoạn gen nhân bản.

- Đọc kết quả trên thạch điện di trong buồng đọc dưới ánh sáng cực tím.

IV. KẾT QUẢ

- Các đoạn DNA được nhân bản theo yêu cầu.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Mẫu phải lấy đúng vùng, đúng chỗ cần xác định sự hiện diện của DNA cần tìm.

-  Dụng cụ lấy bệnh phẩm và đồ dùng chứa bệnh phẩm phải đảm bảo tinh sạch về mặt sinh học, chỉ sử dụng một lần, nếu không sạch, các acid nucleic của tác nhân đích có trong mẫu sẽ bị phân hủy hay mẫu thử sẽ chứa các chất ức chế phản ứng khuyếch đại sau này.

- Tùy loại mẫu thử, tùy tác nhân đích là vi khuẩn, virus, nấm hay tế bào có nhân và tùy acid nhân phải tách chiết là DNA hay RNA để lựa chọn phương pháp tách chiết thích hợp. Nếu mẫu thử là mô sinh thiết, nên chọn phương pháp phenol/clorofom hơn là phương pháp BOOM.

- Cần kiểm tra bộ kit tách chiết có đảm bảo độ nhạy không trước khi thực hiện kỹ thuật.

- Ngăn ngừa nhiễm chéo và loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuyếch đại.

- Chọn tỷ lệ % agarose phù hợp, tỷ lệ trung bình hay dùng là 2%, nhưng đối với các sản phẩm khuếch đại lớn > 500bps, nên dùng loại 1,5%, còn loại khuyếch đại < 100bps, nên dùng agarose > 2,5%.

- Cần tuyệt đối tuân thủ an toàn khi sử dụng ethidium bromid.

- Trong một số trường hợp, kỹ thuật không thực hiện được với những phân tử DNA có kích thước > 3kb. PCR cho kết quả tốt nhất ở DNA có độ dài < 1,5kb.

- Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzym phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA polymerase bị phá hủy. Vì vậy, cần bổ sung enzym sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase và phải liên tục lưu ý suốt quá trình thực hiện kỹ thuật.

Các tin tức liên quan

CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHUỘM MẢNH CẮT MÔ TRONG PARAFIN

CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHUỘM MẢNH CẮT MÔ TRONG PARAFIN

3/13/2021 3:13:15 PM

CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHUỘM MẢNH CẮT MÔ TRONG PARAFIN

Xem tiếp
DANH MỤC PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ

DANH MỤC PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ

1/17/2019 7:00:07 PM

Các thao tác kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học hiện đại: tách chiết, điện di, nhân gene bằng phương pháp PCR; thiết kế vector tái tổ hợp, chuyển gene ngoại lai vào tế bào chủ E. coli (tế bào vi khuẩn) phục vụ mục đích tạo dòng, làm thư viện DNA, v...v,

Xem tiếp
DANH MỤC TRANG THIẾT BỊ PHÒNG KIỂM NGHIỆM HẠT GIỐNG

DANH MỤC TRANG THIẾT BỊ PHÒNG KIỂM NGHIỆM HẠT GIỐNG

9/7/2018 1:18:06 PM

Việc kiểm nghiệm chất lượng hạt giống yêu cầu các phương pháp thử và thiết bị đã được kiểm tra để đảm bảo phù hợp với mục đích và có giá trị. Hạt giống là một sản phẩm sinh học sống và các đặc tính của nó không thể dự đoán được một cách chắc chắn như đối với các nguyên liệu vô cơ khác. Các phương pháp thử được sử dụng phải dựa trên kiến thức khoa học và kinh nghiệm được tích lũy trong quá trình kiểm nghiệm và kiểm soát chất lượng của hạt giống.

Xem tiếp
TIÊU CHUẨN VÀ THIẾT BỊ QUAN TRẮC MÔI TRƯỜNG LAO ĐỘNG

TIÊU CHUẨN VÀ THIẾT BỊ QUAN TRẮC MÔI TRƯỜNG LAO ĐỘNG

9/6/2018 1:18:23 PM

Việc thực hiện quan trắc môi trường lao động tại cơ sở lao động một mặt giúp kiểm soát các yếu tố nguy hại, bảo vệ sức khỏe nhân viên. Mặt khác, kết quả quan trắc đánh giá mức độ tiếp xúc còn là cơ sở để thực hiện việc chế độ phụ cấp độc hại cho nhân viên theo đặc thù khoa phòng

Xem tiếp
PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO

PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO

9/5/2018 7:57:00 PM

Ứng dụng: nghiên cứu sự phát triển của tế bào, sự phân chia, và tổ chức tế bào Phòng thí nghiệm được xây dựng nhằm phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu về nhiều lĩnh vực ứng dụng: Vi sinh y học, Kỹ thuật lên men, Công nghệ protein và vaccines tái tổ hợp, Các chế phẩm từ vi sinh như enzyme, thuốc trừ sâu sinh học, vaccine, dược liệu; Phát triển công nghệ tế bào...

Xem tiếp
DANH MỤC THIẾT BỊ GIẢI PHẪU BỆNH

DANH MỤC THIẾT BỊ GIẢI PHẪU BỆNH

9/4/2018 7:27:14 PM

Thiết bị giải phẫu bệnh là những thiết bị dùng trong khoa giải phẫu bệnh của các bệnh viện. Các khoa giải phẫu bệnh có nhiệm vụ chẩn đoán, đào tạo và nghiên cứu. Khảo sát hồi cứu nhiều bệnh bệnh lý tính và tạo được nhiều nhận thức mới về bệnh học. Chẩn đoán thường qui, hóa mô miễn dịch và cắt lạnh thường qui trong lúc phẫu thuật cắt khối u. Tìm hiểu nguyên nhân của sự chết theo yêu cầu của thân nhân người chết và thầy thuốc điều trị,…

Xem tiếp
DANH MỤC THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM TỐI THIỂU XỬ LÝ NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP

DANH MỤC THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM TỐI THIỂU XỬ LÝ NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP

9/11/2016 3:04:47 PM

Danh mục thiết bị thí nghiệm tối thiểu trong nghiên cứu Xử lý nước thải công nghiệp là danh mục bao gồm các loại thiết bị gồm dụng cụ, mô hình, bộ phận của thiết bị, thiết bị hoàn chỉnh… tối thiểu

Xem tiếp
PHÒNG THÍ NGHIỆM KIỂM ĐỊNH/HIỆU CHUẨN THIẾT BỊ QUAN TRẮC MÔI TRƯỜNG

PHÒNG THÍ NGHIỆM KIỂM ĐỊNH/HIỆU CHUẨN THIẾT BỊ QUAN TRẮC MÔI TRƯỜNG

9/10/2016 10:03:26 PM

Phòng kiểm chuẩn được trang bị các thiết bị hiện đại, độ chính xác cao để thực hiện hiệu chuẩn trạm quan trắc không khí tự động (SO2, CO, NO-NO2-Nox, O3, THC, BTEX…), trạm quan trắc nước tự động (pH, DO, EC, TDS, ORP…) và các thiết bị bán tự động (đo khí, nước đa / đơn chỉ tiêu).

Xem tiếp
DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC CHẤT

DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC CHẤT

9/10/2016 9:24:40 PM

DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC CHẤT

Xem tiếp
DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

9/10/2016 4:33:41 PM

DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Xem tiếp
DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG

DANH MỤC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG

8/31/2016 4:42:34 PM

Phòng thí nghiệm chất lượng môi trường là phòng thí nghiệm có nhiệm vụ và chức năng: Thực hiện các chương trình Quan trắc, Giám sát, Đo đạc và Phân tích mẫu chất lượng môi trường Đất, Nước và Không khí. Tham gia thực hiện các đề tài nghiên cứu thuộc lĩnh vực môi trường; ngoài ra, PTN Chất lượng Môi trường còn thực hiện các khóa đào tạo ngắn hạn về thực hành lấy mẫu, đo đạc và phân tích mẫu nước, khí và đất .

Xem tiếp
Danh mục Thiết bị phòng Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm - Thực phẩm chức năng

Danh mục Thiết bị phòng Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm - Thực phẩm chức năng

8/31/2016 3:16:03 PM

Phòng kiểm nghiệm có chức năng kiểm tra, đánh giá , xác định chất lượng thuốc, mỹ phẩm, dược phẩm, thực phẩm chức năng... Thẩm định tiêu chuẩn dược liệu.

Xem tiếp

DANH MỤC PHÒNG THÍ NGHIỆM

Phòng Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm

Phòng TN An toàn VS Thực phẩm

Phòng TN Hóa cơ bản

Thiết bị Hóa dược và Bào chế

Phòng TN Vi sinh & SH phân tử

Thiết bị Y tế (Điện tử - Hình ảnh)

Phòng sạch - Phòng IVF

Thiết bị Chăn nuôi Thú Y

Thiết bị Nuôi trồng thủy sản

STECH INTERNATIONAL CO., LTD.

CÔNG TY TNHH XUẤT NHẬP KHẨU VẬT TƯ KHOA HỌC QUỐC TẾ

Trụ  sở : BT1B-A312, Khu đô thị Mễ Trì Thượng, Phường Mễ Trì, Quận Nam Từ Liêm, Thành phố  Hà Nội. 

VPHCM: Số 103, Đặng Thùy Trâm, Phường 13, Q. Bình Thạnh, TP HCM  

Điện thoại: 0919.278.276 - 024.32005678 (máy lẻ 201) Ms.Trinh

Email: thietbimoitruongstech@gmail.com

Website: thietbimoitruong.info

Top

  0919.278.276 Ms.Trinh