THAO TÁC TRONG PTN NUÔI CẤY VI SINH VẬT (Phần 2)

THAO TÁC TRONG PTN NUÔI CẤY VI SINH VẬT (PHẦN 2)

Cung cấp những kiến thức về kỹ năng thực hành các chỉ tiêu cơ bản trong đánh giá kiểm tra môi trường bằng phương pháp vi sinh vật  trong việc phân tích vi sinh trong nước, đất và không khí. Nhận diện các đa dạng của vi sinh vật trong môi trường cùng sự phát triển và ảnh hưởng của chúng.

CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT

1. Các phương pháp gieo cấy:

1.1 Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác:

- Dán nhãn ghi Tên giống vi sinh vật, Ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một chút.

- Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy

- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống ra

- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống.

- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền.

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông

- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

- Chú ý:

• Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay que cấy.

• Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ ống hút sau khi đã tháo giấy bao gói.

• Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch crômic để khử trùng.

1.2. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:

Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.

- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên

- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo:

+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.

+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu

􀂃 Hình chữ chi

􀂃 Hình vòng xoắn

􀂃 Hình vạch ngang song song

1.3 Phương pháp cấy trên thạch đứng: Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí.

- Sử dụng que cấy hình kim

- auk hi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ.

- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tuỳ yêu cầu.

- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường

1.4. Phương pháp cấy trên đĩa pêtri:

Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:

* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:

- Để đĩa pêtri lên bàn.

- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp chung.

- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.

- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:

+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch

+ Theo những đường song song

+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc

* Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật và cấy một lượng khá nhiều giống. Có 2 cách:

- Cách 1:

+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 50⁰ C.

+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.

+ Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng.

+ Xoay tròn đĩa pêtri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.

+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.

- Cách 2:

+ Hút 0,1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa pêtri có môi trường đặc.

+ Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa.

+ Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loài vi sinh vật.

III. Các phương pháp nuôi vi sinh vật :

Để đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện nuôi dưỡng chúng. Các điều kiện đó bao gồm:

- Nhiệt độ: Tuỳ loài vi sinh vật khác nhau, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó.

- Độ ẩm: Để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi cần:

- Đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường.

- Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm.

- Ôxi (O2):

(i) Đối với vi sinh vật hiếu khí:

+ Cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2.

+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải.

+ Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật.

+ Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ.

(ii) Đối với vi sinh vật kị khí: Hạn chế sự tiếp xúc với oxi bằng cách; Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin; Cấy trích sâu vào môi trường đặc.

Nuôi cấy trong bình hút chân không. Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn kín lại .Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2. Để nguội 450C. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2.

- Kết quả của việc nuôi cấy:

Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy:

- Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường.

- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng:

+ Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục.

+ Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy.

- Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy của cột môi trường.

IV. BẢO QUẢN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT

4.1. Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

1. Phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường mới:

- Phương pháp này áp dụng để bảo quản tất cả các loại vi sinh vật.

- Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu.

- Nhược điểm: Tốn môi trường, công sức và thời gian. Phẩm chất ban đầu của giống có thể bị thay đổi do nhiều nguyên nhân khó xác định cụ thể trong quá trình cấy truyền.

2. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng:

- Yêu cầu của phương pháp này là sử dụng dầu khoáng như parafin lỏng hay vazơlin phải trung tính, có độ nhớt cao, không chứa các sản phẩm độc với vi sinh vật và vô trùng.

- Cách bảo quản:

+ Khử trùng dầu khoáng bằng cách hấp ở 120⁰C trong 2h. Sau đó sấy khô ở tủ sấy (170⁰ C) trong 1 - 2h; để nguội

+ Đối với vi sinh vật kị khí :

+ Hạn chế sự tiếp xúc với ôxi bằng cách :

* Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin

* Cấy trích sâu vào môi trường đặc.

* Nuôi cấy trong bình hút chân không

* Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi hút lên không và hàn kín lại

* Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2. Để nguội 45⁰ C. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2.

+ Đổ lên bề mặt môi trường có vi sinh vật phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm.

+ Dùng parafin đặc hàn kín miệng ống, bình nuôi VSV.

- Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến dưỡng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại.

Môi trường không bị mất nước và khô.

3. Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt

* Trên đất, cát: Dùng để bảo quản các chủng tạo bào tử tiềm sinh (hoặc bào tử vô tính) với thời gian bảo quản từ một đến nhiều năm.

- Cách bảo quản:

+ Đất, cát đem rây để lấy hạt đều và ngâm trong HCl hay H2SO4 đậm đặc 8 - 12h để loại bỏ các axit hữu cơ trong cát.

+ Rửa kỹ và giữ ở điều kiện vô trùng.

+ Sấy khô và giữ ở điều kiện vô trùng

+ Đổ đầy cát vào ống nghiệm có vi sinh vật phát triển trên môi trường thạch và lắc thật đều.

+ Rót toàn bộ cát lẫn vi sinh vật vào 1 ống nghiệm khác.

+ Hàn kín miệng ống nghiệm này sẽ bảo quản được rất lâu.

* Trên hạt: Dùng để bảo quản các chủng có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không. Thời gian bảo quản có thể tới 1 năm.

- Cách bảo quản:

+ Hạt ngũ cốc (lúa, bobo) được rửa sạch.

+ Nấu cho hạt vừa nứt, để ráo nước.

+ Cho vào các ống nghiệm các hạt ngũ cốc nói trên.

+ Phủ trên mặt các hạt này một lớp bông thấm nước nấu hạt ngũ cốc.

+ Cấy giống vi sinh vật trên lớp bông cho mọc thật dầy.

+ Giữ ở nhiệt độ 15 – 20⁰ C.

4. Phương pháp đông khô:

Phương pháp này làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do. Đồng thời làm giảm, thậm chí làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật. Nhờ đó chúng có khả năng chịu được nhiều tác động của ngoại cảnh.

- Phương pháp này dùng nhiều trong sản xuất, thời gian bảo quản lên tới vài chục năm.